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Tierversuchsfreie Methoden

Alle hier vorgestellten Ersatzmethoden basieren auf dem Einsatz humanen Materials, also auf Blutproben oder Zell-/Gewebeentnahmen bzw. Biopsien. Hinzu kommen die Entwicklungen physikalischer Testsysteme, computer-gestützter in silico-Methoden sowie bildgebender Verfahren.

1. Der Einfluss von Blutplättchen auf die Funktion bestimmter Immunzellen (Dendritische Zellen), in vitro untersucht in einem Parallelplatten-Flusskammersystem (9)

blutspenderBlutspenden gesunder Probanden wurden verwendet, mit Gerinnungshemmern versetzt, fraktionell zentrifugiert und die Blutplättchen (Thrombozyten) isoliert. Zudem isolierten die Forscher Vorläuferstadien Dendritischer Zellen (ein Zelltyp des angeborenen Immunsystems). Sie kultivierten die Dendritischen Zellen mit wachstumsfördernden Substanzen (käuflich erwerbbar). Die Forscher untersuchten dann das Anheftungsverhalten der Dendritischen Zellen unter statischen und unter dynamischen Bedingungen in einem konstruierten Flusskammersystem.

Für die statische Untersuchung wurden die Thrombozyten in Mikrotiterplatten zusammen mit Collagen (ebenfalls käuflich erwerbbar) zusammen gebracht und für zwei Stunden angezüchtet. Dann gaben sie die Dendritischen Zellen hinzu und ließen das Ganze für 30 Minuten wirken. Nach einem Waschschritt konnte nun das Befestigungsverhalten der Dendritischen Zellen auf den Blutplättchen mit einem Phasenkontrastmikroskop untersucht werden.

mikrotiterplatteFür die Untersuchung unter dynamischen Bedingungen wurde ein Glasobjektträger mit Collagen überzogen und dieser in ein Parallelplatten-Flusskammersystem eingesetzt und mit einer Pufferlösung umschwemmt. Hiernach wurden die Thrombozyten auf das Collagen aufgebracht. Nach einer Einwirkzeit von 2 Stunden gaben die Wissenschaftler Dendritische Zellen in die Pufferlösung. Das Verhalten der unterschiedlichen Zelltypen wurde per Video aufgezeichnet. In dem Flusskammer-system konnten die Forscher zeigen, dass die Anwesenheit der Thrombozyten die Befestigung und Immunzellreaktion der Dendritischen Zellen in vitro auslösen kann. Die Thrombozyten setzen eine Vielzahl an „Entzündungsstoffen“ frei (z. B. Interleukin-1), die auf den Reife- und Funktionsprozess der Dendritischen Zellen Einfluss haben.

Wenn sich die Dendritischen Zellen an die Thromozyten angeheftet haben, werden sie veranlasst, die Entzündungsreaktion zu regulieren. Im Rahmen dessen locken sie einen weiteren wichtigen Immunzelltyp an. Die Dendritischen Zellen verhalten sich dabei unter konstruierten Fließbedingungen ähnlich wie unter in vivo-Bedingungen (im lebenden Patienten). Das konstruierte Parallelplatten-Flusskammersystem dient dazu, die Situation in vivo-ähnlicher zu gestalten: Unter kontrollierten Druckverhältnissen lassen sich neben dem An- und Abtransport von Nähr- und Stoffwechseabfallstoffen auch die auftretenden Scherkräfte simulieren.

Mit einem Transmissionselektronenmikroskop untersuchten die Forscher, ob die Thrombozyten von den Dendritischen Zellen aufgenommen (phagozytiert) wurden. Anhand bestimmter Tests konnten sie feststellen, dass die Thrombozyten in den Dendritischen Zellen einen programmierten Zelltod (sogenannte Apoptose) auslösen. Dieser Prozess ist ein wichtiges Merkmal beim fortgeschrittenen Stadium der Atherosklerose. 

Für die Entwicklung eines Strömungsmodell und der Möglichkeit, realistische Durchfluss-Szenarien in Blutgefäßen für die Atheroskleroseforschung zu untersuchen, hat Dr. Harald F. Langer 2006 den Ursula-Händel-Tierschutz-forschungspreis erhalten. Auch andere Gruppen arbeiten mit Flusskammersystemen: Eine Forschergruppe hat das Parallelplattenmodell zu einem Stufenmodell weiter entwickelt. Letzteres dient u.a. dazu, nicht nur laminare Strömungsverhältnisse, sondern auch einen Scherkraftgradienten, Fließtrennungen und Fließrezirkulationen zu erzeugen, wie sie um Plaques in den Blutgefäßen des Patienten eintreten würden (10).

Kritik
Diese Untersuchung wurde 2007 parallel gleichzeitig an Mäusen durchgeführt. Falls diese Konstruktion sich für derartige Untersuchungen als zuverlässig und reproduzierbar erweist, könnten die Forscher den Tierversuch unterlassen und nach neuen Wegen suchen, z. B. mit ergänzendem Einsatz bildgebender Methoden am Patienten. Auch können die Befunde durch vorliegende klinische Daten gestützt werden.

2. Dreidimensionales Ko-Kulturenmodell zur Untersuchung der Entstehung Plaques (Ablagerungen), einem späteren atherosklerotischen Stadium (11)

Ein interessantes Modell ist das Ko-Kulturenmodell von Prof. Dr. Bernhard Dorweiler aus Mainz. Hier werden humane glatte Muskelzellen zusammen mit menschlichen Endothelzellen in einer abbaubaren Fibrinmatrix kultiviert. In der Kultur bildet sich eine mehrlagige Schicht glatter Muskelzellen sowie eine dicht am Kulturgefäß haftende Endothelschicht.

Dadurch wird die innere Wand des Blutgefäßes (sogenannte Neo-Intima) künstlich erzeugt. Sie hat sich als voll funktionsfähig gezeigt, da sie in der Lage war, wichtige Substanzen abzusondern, wie Laminin oder Collagen.  Durch übermäßige Hinzugabe von LDL (low density lipoprotein) wurde ein Überschuss dieses Proteins simuliert, um zu untersuchen, welchen Einfluss dieser LDL-Überschuss auf die Zellsituation in der Kultur hat.

Gleichzeitig fügten die Forscher Vorläuferzellen von Immunzellen (Monozyten genannt) des Menschen hinzu. Sie beobachteten, dass die Fette sofort in die Schichten zwischen gewachsenem Endothel und glatten Muskelzellen eindrangen und die Monozyten sich an die Endothelwand hefteten. Die Monozyten drangen durch die Endothel-zellen, nahmen Fette in sich auf und bildeten nach 6 Tagen sogenannte Schaum-zellen. Zudem wurde ein Entzündungsbotenstoff (Interleukin-8) freigesetzt. 

In einem anderen Forschungsprojekt wurde mit dem Ko-Kulturenmodell die Funktion eines anderen Immunzelltyps, der neutrophilen Granulozyten untersucht (12). Im Rahmen dessen untersuchten die Forscher Gewebeproben immunhistochemisch und mit dem Transmissionselektronenmikroskop. 

Bewertung
Das 3D-Ko-Kulturenmodell wird aktuell in einer Forschungsarbeit verwendet, die von der Deutschen Forschungsgemeinschaft finanziert wird (13). Potenziell halten die Forscher das Modell für geeignet, charakteristische Stadien der Atherosklerose in Langzeit-Kultur (bis zu sechs Wochen) zu studieren. Durch eine Ergänzung mit molekularbiologischen Methoden, so schreiben sie in ihrer Veröffentlichung, kann das Modell auch zur Untersuchung von intra- und extra-zellulären Signalwegen eingesetzt werden. Sie sind überzeugt, mit ihrem Modell die Lücke zwischen einer in vitro-Monokultur und dem fragwürdig übertragbaren Tierversuch schließen zu können und so zu einer Reduktion der Tierversuche beizutragen. 

3.: Humane Endothelzellen in Kultur zur Untersuchung der Endothelphysiologie, Endothelbiopsie (14)

In bestimmten Fragestellungen kann es ausreichend sein, im Gegensatz zum eben beschriebenen Ko-Kulturenmodell mit einem einzelnen Zellkulturtyp zu arbeiten. Veränderungen des Endothels stellen ein Primärereignis bei der Entstehung von Gefäßkrankheiten dar (14). Die Forscher untersuchten den Einfluss zu hohen Blutzuckers auf Endothelzellen, indem sie sich mit der Umsetzung der Gene in ein Protein (Genexpression und Proteinexpression) befassten. Sogenannte HUVEC-Zellen (humane umbilical vein endothelial cells) können zu diesem und anderen Zwecken käuflich erworben werden.

Sie werden aus der Nabelschnurvene Neugeborener gewonnen (15). Zirkulierende Endothelzellen lassen sich aber auch im Blut von Diabetes-Typ2-Patienten und gesunden Probanden (Vergleich) finden. Sie können aus der Blutprobe isoliert und analysiert werden (16). Die Forscher gewannen von Probanden mit fortgeschrittener Gefäßkrankheit und gesunden Freiwilligen Gewebematerial. Mittels eines sehr dünnen Drahts in J-Form, der durch einen Gefäßkatheter in die Armvene eingebracht wurde, konnten Endothelzellen vorsichtig der Blutgefäßwand entnommen werden.

Nach dem Procedere befanden sich an der Drahtspitze einzelne Zellen, die die Wissenschaftler in ein Probengefäß mit Pufferlösung überführten. Sie reinigten die Zellen und lösten sie auf, um eine bestimmte Form genetischen Materials (ribosomale Nukleinsäure = RNA) nach einem bestimmten gentechnischen Verfahren isolieren zu können. Die RNA dient naturgemäß als Vorlage für die Herstellung von Proteinen. Das gewonnene genetische Material wurde vervielfältigt und in eine komplementäre Matrize (copy-DNA) umgeschrieben. Diese Matrize vervielfältigten die Forscher abermals. Mit Hilfe bestimmter gentechnischer Methoden wurde das Genmaterial analysiert und die Daten der erkrankten und gesunden Probanden miteinander verglichen. Verschiedene Methoden der Endothelbiopsie für die Atheroskleroseforschung diskutieren auch andere Wissenschaftler (17). 

4. Untersuchung zirkulierender Monozyten aus humanem Blut (18), (19)

In einigen Fällen lassen sich Erkenntnisse auch direkt aus dem Blut von Patienten  erzielen und der Funktionsmechanismus durch Vergleich mit gesunden Probanden klären. In einem Fall wurde untersucht, ob und wie zwei unterschiedliche Immunzell-Vorläuferzelltypen (Monozyten), die sich durch ein Oberflächenmolekül unterscheiden, auf ein in vitro-Milieu mit übermäßigem Cholesterin reagieren. Dafür wurden die Monozyten aus dem Blut kranker und gesunder Probanden isoliert und mit oxidiertem LDL sowie nicht-denaturierten LDL von Gesunden zusammengebracht. Die Reaktion der Immunzellen wurde durchflusszytometrisch analysiert, ein Teil unter dem Laserscanning-Mikroskop untersucht. 

In einer anderen Studie wurde die Beziehung zwischen blutzirkulierenden Immunzellen (Monozyten) von Patienten mit erblich bedingter Hypercholesterinämie (zu hoher LDL-Cholesterinspiegel wegen Gendefekt auf dem LDL-Rezeptor), erhöhten Blutfetten und dem Lipoproteinstoffwechsel untersucht (18). Hierfür wurden Proben sowohl von Patienten genommen, die den Gendefekt auf beiden Chromosomen zeigten (homozygot), als auch solche Proben von Patienten, die den Gendefekt nur auf einem Chromosom hatten (heterozygot).

Zum Vergleich wurden Proben von gesunden Freiwilligen untersucht. Die Monozyten wurden isoliert, gereinigt und ihr Reinheitsgrad durchflusszytometrisch bestimmt. Per Gaschromatographie-Massenspektrometer maßen die Forscher die Cholesterol- und oxidierte Cholesterol-Metabolitenkonzentration im Blutserum. Von den isolierten Immunzellen wurden sogenannte Genexpressionsprofile angefertigt und per Mikroarray-Verfahren die Menge an Genprodukten bestimmt. Die verschiedenen Proteine wurden per Westernblot-Verfahren untersucht. Die Wissenschaftler verglichen alle Ergebnisse der Zellphysiologie der zirkulierenden Monozyten erkrankter Personen mit den Befunden der gesunden Probanden.

5. Arterien-auf-dem-Chip-Modelle (20)

chip mit 4 kompartimentenMittlerweile haben Forscher mikrofluidische Chipplattformen entwickelt, in denen kleinste Blutgefäße mit einem Durchmesser von 0,25 Millimeter und 1,5 Millimeter Länge für Testzwecke genutzt werden. Solcher Art kleinste Gefäße künstlich herzustellen ist derzeit noch eine große Herausforderung. Die Arterien müssen voll funktionsfähig sein und erlauben möglicherweise in Zukunft eine Reduktion der Tierversuchszahlen, z. B. bei der Wirkstoffentwicklung gegen Atherosklerose (sogenanntes Drug screening).

Die Wissenschaftler zielen bei der Miniaturierung durch Chip-Modelle darauf ab, eine Vielzahl an Proben gleichzeitig bearbeiten zu können (sogenanntes Hochdurchsatzverfahren). Bis vor Kurzem haben sich z. B. kanadische Forscher der Universität Toronto noch der filigranen Gefäße der Maus bedient, um z. B. eine Belastbarkeit und Beständigkeit sehr kleiner Arterien bei unterschiedlichen Druckverhältnissen testen zu können (20). Fortschritte bei den tiereinsatzfreien Verfahren sind aber auch hier bereits erzielt worden.

Die Herstellung künstlicher Blutgefäße fällt in den Bereich des Tissue Engineering (21, 22). Am Hamburger universitären Herzzentrum hat man bereits Blutgefäße aus Polyurethan künstlich herstellen können, die von menschlichen Fibroblasten und glatten Muskelzellen erfolgreich besiedelt wurden. Dies war bis zu einem Gefäßdurchmesser von 3 Millimetern erfolgreich. Sie behielten ihre Funktionsfähigkeit hinsichtlich Schwerkräften, Druck und Fluss (21). Die Forscher sind zuversichtlich, derartige Modelle zukünftig in der Atheroskleroseforschung einsetzen zu können. 

chipsystem

Erfolgversprechende Ergebnisse haben auch Forscher aus Jena, u.a. die Arbeitsgruppe um Sandy Mosig erzielt. Auf einem Chip sind vier Kavitäten über Kanäle miteinander verbunden (siehe Abbildung im Folgenden). In jeder Kavität wächst in dreidimensionaler Form ein anderer Zelltyp: in einer Kavität werden Blutgefäße nachgebildet, in einer anderen Lebergewebe, auf einer weiteren wächst Lungengewebe. Die künstlichen Gewebe werden mit notwendigen Nährstoffen über ein Leitungssystem mit zwei Pumpen versorgt (siehe Foto 2). Der Nährlösung lassen sich Immunzellen, Medikamente oder andere zu untersuchende Substanzen hinzufügen.

Dabei legen die Wissenschaftler Wert darauf, dass das wachsende Gewebe von oben und unten mit Nährstoffen versorgt werden kann und nicht an einer Seite fest mit dem Untergrund verwachsen ist, sondern sich möglichst natürlich dreidimensional ausbilden kann. Die Vernetzung verschiedener Gewebe macht Sinn, denn so lassen sich z. B. gegenseitige Stoffwechselbeeinflussungen bei der Forschung an toxischen Stoffen oder Medikamenten studieren. Die Forschung an den künstlichen Miniblutgefäßen wird von der Zentralstelle zur Erfassung und Bewertung von  Ersatz- und Ergänzungsmethoden zum Tierversuch (ZEBET) beim Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) finanziell unterstützt.

5. In silico: Konstruktion eines Atherosklerose-Simulationsmodells aus Magnet-Resonanz-Imaging Bildern (MRI) (23)

Für die Herstellung der Computersimulation entnahmen die Wissenschaftler zunächst zehn Beinschlagadern von verstorbenen Patienten. Es wurden sowohl  Blutgefäße verwendet, die geringgradige als auch hochgradige atherosklerotische Blutgefäßschädigungen aufwiesen. Die Gefäßabschnitte wurden ihrer natürlichen Länge nach gestreckt und ein Gefäß eingeführt, das normalerweise zur Therapie verengter arterieller Blutgefäße eingesetzt wird, indem man von innen das Blutgefäß durch eine Art Ballondruck dehnen kann und damit gegen die Gefäßverengung arbeitet (Ballonangioplastie, 23).

Das Gerät wurde durch die jeweilige Gefäßhülle geschoben und an den geschädigten Stellen positioniert. Dann wurden Magnetresonanz-aufnahmen gemacht. Die Arterien wurden mit dem Gerät und unterschiedlichen Drücken, wie sie auch durch den Blutdruck bzw. Bluthochdruck vorkommen würden nach und nach von einem klinische Ganzkörpermagnet-resonanztomografen gescannt. Mit Ausnahme der Stellen mit den atherosklero-tischen Schäden wurden die Arterien an allen anderen Stellen bis auf zu 6 bar „aufgepumpt“ und auf diese Weise fotografiert. Die Arterien wurden jeweils in Hälften geschnitten und für histopathologische Untersuchungen genutzt.

Die erhaltenen Bilderstapel wurden zu dreidimensionalen Oberflächen zusammengesetzt und zwar entsprechend der unterschiedlichen Druckstadien. Auf diese Weise konnte ein morpho-mechanisches Modell der erkrankten menschlichen Beinschlagadern hergestellt werden. Die Wissenschaftler konnten verschiedene Stadien der atherosklerotischer Plaques darstellen. Auf der Basis des hrMRI (high resolution Magnetresonanz-Imaging) ließen sich genetische Veränderungen am Computer simulieren.Die Forscher geben an, dass das Modell um verschiedene Aspekte erweitert und zu einem Simulationsprogramm weiter entwickelt werden kann. 

Eine weitere in silico-Methode basiert auf einer Datenbank mit Variationen einzelner Basenpaare im DNA-Strang, allerdings stammen diese Informationen über Variationen von genetisch modifizierten Mäusen. Im Modell wird versucht, einen Einfluss dieser Variationen auf die Merkmalsausprägung zu ermitteln, wobei dies schwierig ist, weil eine Vielzahl an Genen hierbei eine Rolle spielen, aber auch Umweltfaktoren und Spontanmutationen üben einen Einfluss aus (23). Diese Datenbank sollte mit humanspezifischen Daten gefüllt werden.

6. Kinetische Modelle (24)

Es gibt bereits kinetische Modelle auf Computerbasis zur Berechnung der Zeit, bis sich ein bestimmtes Atherosklerosestadium (z. B. der Gefäßverschluss) entwickelt hat. Jedoch basieren die Erkenntnisse derzeit noch auf Grundlagen aus dem Tiereinsatz (24). Hier stehen die Arbeiten erst ganz am Anfang. 

7. Kleine Einzeltests

Die unter dieser Rubrik erfassten Tests sind kleine Tests und dienen innerhalb einer Untersuchung oft als ein Baustein innerhalb einer Testreihe. Sie untersuchen meist die Eigenschaften und das Verhalten der verwendeten Zellen oder Gewebe. Meist werden sie in Kombination durchgeführt und werden Zelldifferenzierungstest, Prolieferationstest, Zelladhäsionstest, Apoptosetest, Phagozytosetest oder Ziel-molekültest genannt.

Fazit
Noch ist der Tiereinsatz trotz der vielfältig geäußerten Kritik an der Übertragbarkeit der Tierversuchsergebnisse nicht beendet worden. Zwischen 2007 und 2010 haben sich Forscher deutlich intensiver mit tierversuchsfreien Verfahren in der Atherosklerose-Forschung auseinandergesetzt als ab 2011. Viele Einzelmethoden wurden bereits entwickelt. Sie werden entweder ergänzend zum Tierversuch eingesetzt, um Detailkenntnisse zu erhalten oder der Tierversuch wird ergänzend eingesetzt, um die Erkenntnisse aus den in vitro-Methoden zu überprüfen. 

Da die Einzel-Methoden nicht geeignet sind, den Tierversuch vollständig abzulösen, erscheint es sinnvoll, aus der Gesamtheit der Tierversuchsersatzmethoden mehrere  zu kombinieren, wie vergleichsweise dem Vorgehen in der Toxikologie: Hier zieht die Mehrzahl der Wissenschaftler und forschenden Unternehmen an einem Strang, um den Tierversuch durch humanspezifische Methoden abzulösen. Gleiches muss auch für die Erforschung von Krankheiten, in diesem konkreten Fall der Atherosklerose erfolgen.

Quellen 

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